实验专区

当前的位置:首页 > 实验专区

发布于:1059 点击量:1059


免疫组化实验

  一、样本总类及样本处理要求:

  1.冰冻切片:取下适当的组织块放于液氮保存。

  2.石蜡切片:取下适当的组织块放于4%多聚甲醛保存。

  3.细胞爬片:将制作好的细胞爬片置于4%多聚甲醛固定30min,换PBS浸没4℃保存。

  二、操作步骤(了解)

  1.固定:根据需要取材后置于福尔马林中固定48小时。

  2.洗涤与脱水:将固定后的组织用流水冲洗,去除残留的固定液和杂质。不同浓度的乙醇逐级脱水,50%、70%、85%、95%直至纯酒精(无水乙醇),每级2小时。70%乙醇中可长期保存。

  3.透明:50%酒精+50%二甲苯中2小时,纯二甲苯两小时,再一次纯二甲苯两小时。

  4.浸蜡:先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1~2小时,再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍各3小时左右。

  5.包埋:将浸好蜡的组织块放入装有蜡液的容器中,摆好组织块位置。待石蜡凝固后将周围多余的石蜡去除,准备切片。

  6.切片:将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧,固定蜡块底座或蜡块,调整蜡块与刀至合适位置,刀刃与蜡块表面呈5度角。调整切片机上的切片厚度为4~7μm,然后切片。

  7.脱蜡:60度30分钟,二甲苯脱蜡 5min×2次

  8.水化:将脱蜡后的切片经100%酒精,95%酒精,85%酒精,75%酒精,双蒸水各3min

  9.抗原修复:置0.01M柠檬酸钠缓冲溶液中95℃微波修复15min。微波过程中避免溶液沸腾,自然冷却。0.02M PBS洗3min×3次。

  10.阻断:加3%H2O2,阻断内源性过氧化物酶,湿盒孵育10min。0.02M PBS洗3min×3次。

  11.封闭:甩去PBS,加非免疫、正常羊血清封闭非特异性抗原,湿盒孵育20℃,30min。

  12.PBS洗3次,加一抗,选择最佳稀释比例。4度过夜最佳。过夜后取出室温放置40分钟,PBS洗3次。加HRP标记二抗(鼠抗,或者兔抗等)40分钟

  13.PBS洗,DBA染色3-10min,自来水冲洗,苏木精复染,0.1%盐酸酒精分化,显微镜下观察,控制染色程度。

  14.脱水:75%酒精,85%酒精,95%酒精,100%酒精。脱水各3min.

  15.透明:二甲苯透明3min×2次。

  16.中性树胶封片。

  17.图像分析

  1)图像采集:通过显微镜、图像采集卡、数码相机采集数字图像、数字图像为标准的jpg文件格式。

  2)物镜倍数:显微镜物镜有×4,×10,×20,×40五种倍数选择(目镜×10)。

  3)距离测量定标:距离可以用显微镜专用校正微尺来标定。标定可在×4,×10,×20,×25,×40条件下进行。步骤是先点击图像中微尺上的两个点,再将它的实际微米数输入计算机,计算机自动计算得到比例因子后存储备用。

  4)消除背景:本命令能把免疫组化中的紫色背景从图像上去除。

  5)选阳性区域:操作时用鼠标器选择棕黄色或棕褐色阳性区域,处理后有效阳性区域用红色表示。此功能可和选阴性区域功能交替使用。

  6)测量:测量方式可选全视场测量。否则,需选择测量区域(用鼠标选择任意区域或选择矩形区域)。

  7)测量结果:免疫组化图像中阳性区域面积及平均光密度值(Optical Density)。

  单位换算:总面积=351000像素点;阳性面积1个像素点= 0.095um 2。

  阳性面积乘以OD值=免疫组化指数,数值的高低代表阳性表达的强弱。

  三、实验结果

  免疫组化实验报告中包含实验所用仪器及试剂、实验操作步骤、所涉及到的抗体信息、免疫组化的图片(包括拍片倍数及阳性面积值)。

我公司目前与多个实验室开展技术合作,拥有WB、免疫组化、ELISA、多肽合成、液质检测、蛋白纯化和芯片中心等数个实验平台,开展的技术服务涵盖免疫组化、WB、ELISA、抗体定制、多肽合成、病理、分子、蛋白、细胞、动物造模等几十项实验,每一项实验都由经验丰富的专业人员负责完成。公司优势是可以承接整体实验课题,从拟写标书,实验设计、动物造模,包括后期检测分析,到整理数据发表文章我们都可以做,如有需要请随时咨询。

联 系 人:赵 勇

联系电话:15310461565/13648388002

Q Q:1308186608/204844101

公司名称:重庆金喜鹊科技发展有限责任公司

在线咨询

电话咨询

15310461565

二维码扫一扫

渝公网安备 50010802002268号