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染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀

10.1交联染色质免疫沉淀(X-ChIP)操作步骤

染色质免疫共沉淀是一种强力的手段,来联系蛋白质或其修饰位点与基因组的关系。染色质分离并用特异性抗体判断是否与 特异性DNA 序列相结合。染色质免疫沉淀法亦可用来检测目的位点在基因组中的时空分布(用芯片或DNA 测序)。本操作规程 详细阐述了交联染色质免疫沉淀(X-ChIP) 实验的具体步骤。

1. 交联和细胞收集

用甲醛来使蛋白质和DNA 相交联。交联的时间很关键,因此需优化。建议样本交联的时间为2-30 分钟。

过度的交联可降低抗原的可结合性和超声的效率。抗原的表位也会被遮盖。甘氨酸可抑制甲醛的作用并终止交联反应。

1.1 取2 个150cm2 培养皿的融合细胞(每皿细胞数约1 X 107 - 5 X 107 个)。向培养基中滴加甲醛以使蛋白和DNA 相交联,甲醛的 终浓度为0.75%(体积百分比),室温下轻轻摇动10 分钟。

1.2 加入甘氨酸至终浓度为125mM,轻轻振荡孵育5 分钟。

1.3 用10ml 冷PBS 洗涤细胞2 次。

1.4 刮下细胞并用5ml 冷PBS 收集,转移至一个50ml 离心管中。

1.5 用3ml PBS 洗涤培养皿,收集剩余细胞至50ml 离心管中。

1.6 1000g 离心5 分钟

1.7 小心吸弃上清液,用FA 裂解缓冲液重悬沉淀(每1 X 107 个细胞加750μl)

用细胞悬液实验时,起始细胞量为1x107- 5x107 个细胞,并按照第一部分的步骤加入体积百分比0.75% 的甲醛和甘氨酸。

离心沉淀细胞(5 分钟, 1000g)。用冷PBS 洗涤3 次,用FA 裂解液重悬沉淀(每1 X 107个细胞加750μl)。然后转到步骤2.1。

2. 超声

当使用组织来进行实验时(见步骤6.2),要得到单细胞悬液,应从此步超声处理开始。

2.1 将裂解液超声处理以使DNA 断裂成约500-1000bp 的片段。不同的细胞系需要不同的超声时间,因此需分别进行优化。

交联后的裂解液应进行超声处理,并优化得到最佳条件。取部分样本按照步骤3 进行DNA 分离。

片段大小应按照图1 所示,用质量百分比1.5% 的琼脂糖凝胶分析。

2.2 超声处理后,4°C,8000g 离心30 秒使细胞碎片沉淀。将上清液转移到新管中。此染色质溶液将用于步骤4的免疫沉淀(IP)。

2.3 每个超声后的样本均取50μl,此样本为抽样样本,用于定量DNA 浓度(见步骤3),并作为PCR 的对照样本。

超声后的染色质可在液氮中速冻,在-80°C 中可保存2 个月。应避免反复冻融。

 

3. DNA浓度测定

3.1 抽样样本用来测定DNA 浓度,为后续IP反应提供数据。用PCR 产物纯化试剂盒(加70μl 洗提缓冲液,转至步骤3.2a)或酚: 氯仿(加350μl 洗提缓冲液,转至步骤3.2b)来纯化DNA。

3.2a 加入2 μl RNA 酶A (0.5 mg/ml)。置于65°C 恒温振荡4-5 小时(或过夜)以解交联。按照PCR 产物纯化试剂盒说明书来纯 化DNA。

用DNA 纯化试剂盒来纯化DNA 时,RNA 浓度过高会干扰DNA 的纯化过程,因此样本中应加入RNA 酶A 处理。

否则纯化柱吸附饱和时产物会大大减少。

3.2b 加入5μl 蛋白酶K (20mg/ml)。65°C 恒温振荡4-5 小时(或过夜)以解交联。酚:氯仿抽提DNA,乙醇沉淀中加入10μl 糖原 (5 mg/ml)。

用100μl 水重悬沉淀。样本可冻存于-20°C 冰箱中。

样本用蛋白酶K处理,可使脂肪与芳香族氨基酸的羧基邻近的肽键断裂。破坏蛋白质和DNA 的交联可帮助DNA的纯化。

3.3 DNA 浓度测定: 取5μl 纯化DNA,加入装有995μl TE的离心管中,200 倍稀释,测定OD260。根据公式DNA 浓度(μg/ml)=OD260 x

10,000,计算每毫升染色质溶液中DNA的浓度。

4. 免疫沉淀

4.1 使用步骤2.2 中得到的染色质溶液继续此操作。建议每个免疫沉淀反应DNA 含量约为25μg。每个样本用RIPA 缓冲液1:10 稀释。 应设一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。

4.2 除对照外,其余样本中均加入一抗。事先应通过预实验得到最佳的抗体加入量。一般来说,每25μg DNA 加入1-10μg 抗体。

4.3 所有样本均加入20μl 的蛋白A/G  磁珠(预吸附了鲑鱼精DNA 和牛血清白蛋白,见步骤4.3a),进行免疫沉淀反应,4°C 旋转过夜。

4.3a 蛋白A/G 磁珠与鲑鱼精DNA 混合液的制备:如果使用蛋白A 和蛋白G 两种磁珠,应将其等体积混合,并用RIPA 缓冲液洗 涤3 次。

吸弃RIPA 缓冲液,加入鲑鱼精DNA 至终浓度75ng/μl,同时加入牛血清白蛋白至终浓度0.1μg/μl。加入等体积RIPA 缓冲液, 常温旋转孵育30 分钟。用RIPA 缓冲液洗涤一次,然后加入等体积RIPA 缓冲液。

应使用蛋白A 磁珠、蛋白G 磁珠或两种混合物。61 页第9.5 部分的表中列出了两种磁珠对不同种属免疫球蛋白的不同亲和性。

4.4 将蛋白A/G 磁珠离心,2000g 1 分钟,弃上清。

4.5 用1ml 洗涤缓冲液洗涤磁珠3 次。2000g 离心1 分钟。

4.6 用末次洗涤缓冲液洗1 次。2000g 离心1 分钟。

如果背景过高,则应增加洗涤次数。或者,在步骤4.2 之前将超声处理后的染色质与蛋白A/G 磁珠共孵育1 小时,以去除背景。

此步将消除与磁珠的非特异行结合。将上清液(超声处理的染色质)转移至一个新管中,然后按照前述步骤4.2 将抗体与磁珠孵育。

5. 洗涤和解交联

5.1 洗涤DNA:向蛋白A/G 磁珠中加入120μl 洗涤缓冲液,30°C 旋转15 分钟。

5.2 2000g 离心1 分钟。将上清液转移至新管中。样本可于-20°C 保存。

5.3 纯化DNA 可用PCR 纯化试剂盒(见步骤3.2a)或酚:氯仿(加280μl 洗提缓冲液,然后参照步骤3.2b)法进行。

5.4 DNA 可用实时PCR 进行定量检测。可用实时PCR 仪自带的软件进行引物和探针设计。或者,也可以使用在线设计工具进行 设计。

6. 组织免疫沉淀中染色质的制备

此步骤描述了从组织中制备染色质,以用于后续的染色质免疫沉淀反应。每个免疫沉淀/抗体反应推荐使用组织30mg,但 组织使用量可根据实际进行调整。每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。每个免疫沉淀反应最适染色质 的量为5-15μg。每次交联免疫沉淀反应之前,需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。应先按照下述方法制备染色质溶液, 再进行交联免疫沉淀反应。所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂(10μl/ml 的PMSF,1μl/ml 的抑肽酶和1μl/ml 的亮肽素,溶于PBS 中)。

本部分摘自Henriette O’Geen, Luis G. Acevedo 和Peggy J. Farnham 提供的操作规程。

6.1 交联

冰冻组织应置于冰上融化(根据组织用量的不同,此过程可能需要几个小时不等)。注意,冰冻组织融化时温度不能过高,

以免蛋白酶活化使组织降解。操作过程中样本要一直置于冰上,所有操作均应迅速完成,以使其处于融化状态的时间最短。 组织切块时要在培养皿中进行,其下要放置一块干冰。

6.1.1 用刀片将冰冻或新鲜组织切成小块(1-3mm3)

6.1.2 取一个空的15ml 锥形离心管,称重,放入组织后再次称重,计算组织重量。

6.1.3 在通风橱中配制交联所用溶液。每克组织加10ml 磷酸盐缓冲液。加入终溶度1.5%(v/v)的甲醛,室温旋转15 分钟。

6.1.4 加入甘氨酸至终浓度0.125M,以终止交联反应。继续室温旋转5 分钟。

6.1.5 组织样本离心,4°C 720 rpm,离心5 分钟。

6.1.6 吸弃培养基,用10ml 冰上预冷的PBS 洗涤。4°C 720 rpm,离心5 分钟,弃掉洗涤缓冲液。

此步所得组织可以用液氮速冻,然后保存于-80°C。应避免反复冻融。

如果随后使用,可以用冷PBS 重悬组织,每克组织加10ml,冰上放置。

6.2 组织降解

应用Becton Dickinson 生产的Medimachine(中型研磨器)处理得到单细胞悬液。每克组织使用2 个中号锥形研磨管(50μm)。

6.2.1 将1ml 枪头的末端剪掉,使吸头口增大。

6.2.2 50-100mg(3-4 块)的组织用1ml PBS 重悬。

6.2.3 将溶液加入锥形研磨管中,研磨2 分钟。

6.2.4 将18 号钝圆的针头连接到1ml 注射器上,将其插入锥形研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中,冰上放置。

6.2.5 重复步骤2.2 直到所有组织均处理完。

6.2.6 镜下观察细胞悬液,以确定得到的是单细胞悬液。如果需要进一步研磨,可在组织中加入更多的PBS,重复步骤2.2 到2.5 直至所有 组织均研磨成均一的悬液。

6.2.7 将细胞离心,1000rpm,4°C,离心10 分钟。估算细胞沉淀的体积以备下一步操作。

6.2.8 小心吸弃上清液,用FA裂解缓冲液重悬沉淀(每1x107 个细胞加入750μl)。

6.2.9 从第2 阶段(超声处理)开始,继续进行交联染色质免疫沉淀反应。

10.2 ChIP 疑难解答提示

无特异性抗体对照时出现背景过高

与蛋白A 或G 非特异性结合

 应采用预清除处理即在加入抗体前,将裂解的样本与磁珠混合1小时然后分离使用。

染色质免疫沉淀所用缓冲液被污染

裂解液和洗涤缓冲液要新鲜配制。

某些蛋白A 或G 磁珠本身会产生很高的背景

某些蛋白A 或G 磁珠会有很高的背景。要找到一个合适的供应商,所提供的产品应在非特异性对照样本中得到背景最低最干净的结果。

结合区域过大使得背景过高分辨率过低

片段过大

针对不同的细胞系,应优化DNA 片段的大小。超声时间和酶孵育时间均应调整。建议DNA 片段不要超过1.5kbp。如果用酶消化染 色质,会得到175bp 大小的单核苷酸酶。

信号过低

染色质片段过小

要得到小于500bp 的染色质片段时,不需进行超声处理。太小的片段会使核小体被误认为核小体间的DNA 而被消化掉。如果进行 末端染色质免疫沉淀,通常酶消化法即能得到所需大小的染色质片段。

交联染色质免疫沉淀时交联时间过长

用甲醛交联10-15 分钟,然后用磷酸盐缓冲液洗净,接着需要加入甘氨酸以终止甲醛的作用。过度交联可能会降低表位的可结合度从 而减少抗体的结合。

原材料不足

建议每个免疫沉淀反应用25μg 染色质

免疫沉淀中抗体不足

建议开始时加入抗体量为3-5μg。如果未检测到信号,可增加抗体量至10μg。

特异性抗体结合受阻碍 在洗涤缓冲液里氯化钠浓度不要高于500mM,否则浓度过高将阻碍特异性抗体结合

细胞裂解不充分

建议用RIPA 缓冲液来裂解细胞

目标区域无足够的抗体

目标区域无表位。应有阳性对照抗体,以确认操作过程无误,如H3K4me3 用于活化的启动子,或者H3K9me3 抗体用于异染色质 位点。

有些单抗不适合做交联染色质免疫沉淀

单抗识别的表位可能会在交联过程中被掩盖,而阻碍位点识别。建议用多克隆抗体,可识别多个表位,这样就增加了免疫沉淀目标 蛋白的几率。

用错了抗体亲和性磁珠

蛋白A 和G 是细菌来源蛋白质,其对不同种的免疫球蛋白的亲和性不同。请使用特异性的亲和基质。建议使用混合好的蛋白A 和蛋 白G 琼脂糖。

免疫沉淀DNA 时PCR 扩增的问题

反应后包括无模板的阴性对照在内均出现很高的信号

实时PCR 所用试剂被污染。建议使用储备液来新鲜配制溶液。

样本中无DNA 扩增

使用标准对照/抽样DNA 以确定样本中引物均有效。

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