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缓冲液和储备溶液

缓冲液和储备溶液

第十一章:缓冲液和储备溶液

11.1 PBS,三乙醇胺缓冲液(TBS) 和三乙醇胺-吐温(TBS Tween) 缓冲液的配制

PBS (10x)

• 80g 氯化钠

• 2.0g 氯化钾

• 14.4g 磷酸氢二钠

• 2.4g 磷酸二氢钾

• 加入800ml 超纯水,混匀,用纯盐酸调节pH 值至7.4,然后加入超纯水至1L。

10倍三乙醇胺缓冲液

• 24.23g 氨基丁三醇氯化氢

• 80.06g 氯化钠

• 加入800ml 超纯水,混匀,用纯盐酸调节pH 值至7.6,然后加入超纯水至1L。

三乙醇胺-吐温缓冲液(含0.1% 的吐温20)

配制1L 溶液:取100ml 10 倍三乙醇胺缓冲液加890ml 超纯水,再加入10ml 吐温20 (10%)

吐温20 很粘稠会粘在量取的枪头上,要确定加入三乙醇胺缓冲液的变性剂体积足够。建议使用10% 的溶液进行配制,这样会比用未稀释

11.2 蛋白质印迹

裂解液

这些缓冲液可保存于4°C 几周,分装后冻存于-20°C 可以保存一年。

乙基苯基聚乙二醇(NP-40)缓冲液

• 150mM 氯化钠

• 1.0% 乙基苯基聚乙二醇(也可用0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 代替)

• 50mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(Tris-HCl),pH 值8.0

• 蛋白酶抑制剂

RIPA缓冲液(放射免疫沉淀测定缓冲液)

• 150mM 氯化钠

• 1.0% 乙基苯基聚乙二醇或0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚

• 0.5% 去氧胆酸钠

• 0.1% SDS(十二烷基硫酸钠)

• 50mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢,pH 值8.0

• 蛋白酶抑制剂

RIPA 缓冲液的变性能力要强于乙基苯基聚乙二醇或聚乙二醇辛基苯基醚,因其活性成分包含了离子型去垢剂SDS 和去氧胆酸钠,在核膜 降解和细胞核提取时非常有用。RIPA 缓冲液产生的背景很低,但其也可使蛋白酶变性。

10% 的去氧胆酸钠储存液(5 克溶于50ml)必须避光保存。

三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液

• 20mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢,pH 值7.5

• 蛋白酶抑制剂

三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇辛基苯基醚缓冲液(用于细胞骨架蛋白)

• 10mM 三羟甲基氨基甲烷,pH 值7.4

• 100mM 氯化钠

• 1mM 乙二胺四乙酸

• 1mM 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸

• 1% 聚乙二醇辛基苯基醚

• 10% 甘油

• 0.1% 十二烷基硫酸钠

• 0.5% 去氧胆酸钠

• 蛋白酶抑制剂

10% 的去氧胆酸钠储存液(5 克溶于50ml)必须避光保存。

非变性裂解缓冲液

• 20mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢,pH 值8.0

• 137mM 氯化钠

• 10% 甘油

• 1% 乙基苯基聚乙二醇/聚乙二醇辛基苯基醚

• 2mM 乙二胺四乙酸

• 蛋白酶抑制剂

用于可溶于变性剂的抗原,其天然型被相应抗体识别。聚乙二醇辛基苯基醚可替代乙基苯基聚乙二醇

无去垢剂型可溶蛋白裂解液

• 5mM 乙二胺四乙酸

• 0.02% 叠氮化纳

• 磷酸盐缓冲液

• 蛋白酶抑制剂 一些可溶性蛋白不需要使用去垢剂。此缓冲液可用于机械裂解细胞,如用注射器反复抽压或用Dounce 匀浆机匀浆。

变性裂解液/用于不容于去垢剂的抗原的裂解液

• 1% 十二烷基硫酸钠

• 5mM 乙二胺四乙酸

使用前加入:

• 10mM 的二硫苏糖醇或β-巯基乙醇

• 蛋白酶抑制剂

• 15U/ml DNA 酶I 仅识别变性蛋白的抗体不会与天然型蛋白结合。在收集和裂解细胞时,要将重悬细胞的变性裂解缓冲液加热。此方法也可用于非离子 型去垢剂无法提取的抗原。使用DNA 酶I 有助于从染色质中抽提蛋白。

电泳和印迹缓冲液

Laemmli 2 倍缓冲液/上样缓冲液

• 4% 十二烷基硫酸钠

• 10% 2-巯基乙醇

• 20% 甘油

• 0.004% 溴酚蓝

• 0.125M 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢 测定pH 值,调整pH 值至6.8

电泳缓冲液

• 25mM 三羟甲基氨基甲烷碱

• 190mM 甘氨酸

• 0.1% 十二烷基硫酸钠 测定pH值,如有必要的话,调整pH 值至8.3

转移缓冲液(湿式)

• 25mM 三羟甲基氨基甲烷碱

• 190mM 甘氨酸

• 20% 甲醇

如有必要的话,pH 值应调节至8.3

大于80 kDa 的蛋白,建议十二烷基硫酸钠终浓度为0.1%。

转移缓冲液(半干式)

• 48mM 三羟甲基氨基甲烷

• 39mM 甘氨酸

• 20% 甲醇

• 0.04% 十二烷基硫酸钠

封闭缓冲液

5% 牛奶或BSA(牛血清白蛋白)

加入三乙醇胺-吐温缓冲液。充分混合后过滤。如不过滤会聚集成斑点,这种小暗点会在显色时影响印迹的效果。

11.3 免疫组化/免疫细胞组化(IHC)

固定缓冲液

福尔马林(10%,中性缓冲液)

• 3.7-4% 甲醛(37-40%)

• 33mM 磷酸二氢钠

• 46mM 磷酸氢二钠(无水)

多聚甲醛(4%,中性缓冲液)

8% 的多聚甲醛

0.2M 磷酸盐缓冲液(PBS),pH值7.4

• 53mM 磷酸二氢钠

• 154mM 磷酸氢二钠

8% 多聚甲醛溶液配制时应60°C 加热搅拌(温度不要超过60°C)。溶液达到60°C 时多聚甲醛溶解,加入500ml 0.2mM 磷酸盐 缓冲液,使0.1mM 磷酸盐缓冲液中含4% 多聚甲醛。小心滴加1 当量的氢氧化钠溶液直至溶液澄清(每500ml 滴加1 至2 滴;如果 仍未澄清,可继续滴加。或者,可在1 至2L 溶液中加入2 粒固体氢氧化钠)。溶液变冷后过滤。

溶液的pH 值应为7.4。不要用酸或碱来调节pH 值!如需要调节,可另配制0.2 M 溶液来调节,溶液可使用单碱或双碱的磷酸钠配 制(视实际情况而定)。

多聚甲醛应新鲜配制。如4°C 过夜保存,第二天使用固定效果不如当天配制的好。可以将多聚甲醛溶液-20°C 冻存,

但为了结果的一致性,组织样本要么都用新鲜配制的多聚甲醛固定,要么都用新鲜融解的多聚甲醛固定。

Bouin 溶液(特别用于保存质地软、结构精细的组织,如脑组织)

• 75ml 苦味酸(饱和的)

• 25ml 甲醛(37-40%)

• 5ml 冰乙酸

• 充分混合

抗原修复液

柠檬酸钠缓冲液,pH 值6.0

• 10mM 柠檬酸钠(二水枸橼酸三钠)

• 0.05% 吐温20

• 混合溶解枸橼酸钠,用1N 盐酸调节pH 值至6.0。 加入吐温20 并充分混合。

室温可保存3 个月,置于4°C 可保存更长时间。

三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液,pH 值9.0

• 10mM 三羟甲基氨基甲烷碱

• 1mM 乙二胺四乙酸

• 0.05% 吐温20

混合溶解,调节pH 值至9.0。加入吐温20 并充分混合。 室温可保存3 个月,置于4°C 可保存更长时间。

含酶的抗原修改缓冲液:

胰蛋白酶储液

0.5% 胰蛋白酶

蒸馏水融解后-20°C 冻存。 氯化钙储存液(1%)

1% 氯化钙 蒸馏水融解后4°C 保存。

胰蛋白酶工作液

• 0.05% 胰蛋白酶(用0.5% 胰蛋白酶储存液配制)

• 0.1% 氯化钙(用1% 氯化钙储存液配制)

• 8ml 蒸馏水

蒸馏水融解,用1M 氢氧化钠调节pH 值至7.8

4°C 可保存3 个月,置于-20°C 可保存更长时间

11.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)

碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液(100mM) pH9.6

抗原或抗体应用包被缓冲液稀释,以使其固定在孔内:

• 29mM 碳酸钠

• 71mM 碳酸氢钠

封闭液:

常用的封闭试剂为1% 牛血清白蛋白、血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶,用PBS 溶解。

 洗涤液:

常用PBS 或含去垢剂(如体积百分数0.05% 吐温20)的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4) (TBST)

抗体稀释缓冲液:

一抗和二抗应用1 倍的封闭液稀释,以减少非特异结合。

11.5 流式细胞术

荧光激活细胞分类检测(FACS)缓冲液/抗体稀释缓冲液

• 10% 胎牛血清

• 1% 叠氮化纳

• 溶解于PBS 中

细胞穿透液

0.1-1% 聚乙二醇辛基苯基醚/乙基苯基聚乙二醇

溶解于PBS 中,也可用吐温20,皂甙,洋地黄皂甙和Leucoperm 等温和的细胞膜溶解物。使用浓度0.5%,溶解于PBS 中

固定液

0.01%-0.1% 多聚甲醛,溶解于PBS 中

11.6 免疫沉淀(IP)

缓冲液配制方法见免疫印迹(western blot)部分 RIPA(放射性免疫测定)缓冲液 缓冲液配制方法见免疫印迹部分

 11.7 染色质免疫沉淀(ChIP)

FA裂解缓冲液

• 50mM 羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾,pH 值7.5

• 140mM 氯化钠

• 1mM 乙二胺四乙酸,pH 值8.0

• 1% 的聚乙二醇辛基苯基醚

• 0.1% 的去氧胆酸钠

• 0.1% 十二烷基硫酸钠

• 蛋白酶抑制剂

RIPA(放射性免疫测定)缓冲液

• 50mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢,pH 值8.0

• 150mM 氯化钠

• 2mM 乙二胺四乙酸,pH 值8.0

• 1% 乙基苯基聚乙二醇

• 0.5% 去氧胆酸钠

• 0.1% 十二烷基硫酸钠

• 蛋白酶抑制剂

洗涤缓冲液

• 0.1% 十二烷基硫酸钠

• 1% 的聚乙二醇辛基苯基醚

• 2mM 的乙二胺四乙酸,pH 值8.0

• 150mM 的氯化钠

• 20mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢,pH 值8.0

末次洗涤缓冲液

• 0.1% 十二烷基硫酸钠

• 1% 聚乙二醇辛基苯基醚

• 2mM 乙二胺四乙酸,pH 值8.0

• 500mM 氯化钠

• 20mM 三羟甲基氨基甲烷-氯化氢,pH 值8.0

洗提缓冲液

• 1% 十二烷基硫酸钠

• 100mM 碳酸氢钠

蛋白酶K

用蒸馏水溶解,浓度为20mg/ml,-20°C 冻存。

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