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靶点筛选

靶点筛选

CRISPR+基因组成像

在后基因组时代,科学家在理解 DNA 内的线性遗传信息与其在细胞核内的三维组织之间的相关性时遇到了相当的挑战。 我们已经知道基因组的三维结构可能在调节基因表达和控制细胞分化中发挥着重要的作用,但对基因组结构、基因表达和细胞行为之间的相关性的进一步研究却很难进行,原因是缺乏可以用于在活细胞中的可视化特异性序列的基因组动力学工具。而 Cas9 能够精确定位于基因组内的特定序列的能力和其操作的简单性,使其成为研究活细胞中基因组动力学的利器。

基于 Cas9 的成像方法将核苷酸相互作用和蛋白质-DNA 相互作用的优点组合到标记内源基因组基因座。科学家将 Sp dCas9 和 EGFP 融合在一起,这样可以可视化活细胞中编码和非编码序列的基因组座位的动力学。科学家使用单个 sgRNA 在整个细胞周期动态中跟踪重复的基因组位点。非重复基因组座位也可以通过共同递送多个 sgRNA 标记位点来标记,甚至有科学家使用类似的策略来标记活的 mESCs 中的内源性着丝粒,近中心区和端粒。

经过一系列的改进,不同的 dCas9-FP 通过和特异性靶向的 sgRNA 融合靶向不同的基因位点,已经实现了在活细胞中同时跟踪多个重复基因位点,且两个正交的 dCas9 可以区分两个距离约 2M bps 的基因组。科学家改造了三种 dCas9 来识别不同的 sgRNA 和 PAM 序列,用来提供同时追踪多个基因位点的动力学的工具,固定的细胞和组织也可以被体外组装的荧光标记的 dCas9-sgRNA 复合物高效地标记,我们称为 CASFISH。与传统的 FISH 相比,CASFISH 使用 dCas9 介导的酶反应进行快速序列特异性标记,更加能够保持细胞和基因组结构。

基因筛选

由于 CRISPR/Cas9 系统具有可以对任何物种基因组的特定位点进行精确编辑的特点,使得这个技术在基因编辑领域大放异彩,更由于其简单易操作、相比 shRNA 具有更加高效的敲除效率(图一中为针对 EGFP 的 sgRNA),也使得大范围的基因功能筛选成为可能。

由于全基因组筛选实验的目标是产生并筛选突变细胞的群体,以鉴定出与特定表型相关的基因。CRISPR/Cas9 可轻松放大到全基因组筛选,根据不同的靶点基因设计出不同的 sgRNA 的质粒并不困难,在得到 sgRNA 文库之后,科学家可以将文库中的 sgRNA 和筛选 marker 结合在一起,并克隆进慢病毒载体,这样在包装出针对每个基因的 CRISPR/Cas9 敲除病毒可以十分高效的敲除大量目标基因,结合适当的正向或反向筛选,再比较不同的细胞中产生的效果,便可以快速的筛选出全基因组范围内潜在的靶点基因(图二)。

很多国外大药厂已经通过这种筛选平台获得了一手的靶点信息,相信在不久的将来,CRISPR 靶点筛选平台会极大的缩短新药靶点开发的时间。

2016 年 9 月:科学家们在刚地弓形虫细胞中进行了全基因组范围的 CRISPR/Cas9 筛选,并找到了潜在的影响寄生虫的必需基因。

12 月:科学家们在 RNF43 突变的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中进行了全基因组范围的 CRISPR-Cas9 筛选,并找到了可以用于治疗该类型癌症的潜在抗体药物。

12 月:艾滋病毒的宿主蛋白对于病毒进入机体和自身复制来说非常重要,可能会是治疗的靶标。科学家们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术开始寻找在艾滋病毒感染治疗的靶标。通过全基因组筛选,发现了 5 个宿主因子,包括 HIV 共受体 CD4 和 CCR5,酪蛋白硫酸转移酶 2TPST2 和溶质载体家族 35 成员 B2(SLC35B2)及活化白细胞粘附分子(ALCAM)。

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